竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其原理：将特异性抗体包被于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，另一组只加酶标记抗原，经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。
其操作步骤为：
1. 将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体
2. 加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结
3. 加入带有酶的抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酶的抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。
4. 洗去检体与带有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，当检体中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少，显色也就越浅。
5. 当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原，或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。